emfret成立于2002年，emfret公司專注心(xin)血(xue)管和(he)血(xue)液系(xi)統研究用抗(kang)體研發和(he)生產，emfret公(gong)司(si)的抗體(ti)不僅適(shi)用于(yu)

流式分析、WB檢測，還可用(yong)于(yu)免(mian)疫組化/免疫熒光(guang)及(ji)免疫共(gong)沉淀檢測。

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抗體(ti)相關實驗技術Protocols

一(yi)、小(xiao)鼠血小(xiao)板表面糖蛋白(bai)的(de)流式細(xi)胞術(shu)分析

緩沖(chong)液和試劑準備：

Tris緩沖鹽(yan)水/肝素（TBS/Hep）：20mM Tris/HCl；137mM NaCl；pH 7.3；含有20U/ml肝素。

磷酸(suan)鹽(yan)緩沖液（PBS）：137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH₂PO₄；8mM Na₂HPO₄；pH 7.14。

改良臺氏液/改良Tyrode''s溶液：134mM NaCl；0.34mM Na₂HPO₄；2.9mM KCl；12mM NaHCO₃；20mM Hepes；pH 7.0；5mM葡(pu)萄糖(tang)；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。

腺苷三磷(lin)酸雙(shuang)磷(lin)酶Apyrase：溶于水（10 U/mL），在-20°C下(xia)儲存。

前(qian)列環素Prostaglandin（Prostaglandin 2, PGI2）：溶于水（1 mM），在-20°C下(xia)儲存。

CaCl₂：1 M溶于水(shui)。

稀釋或洗(xi)滌全血的(de)制(zhi)備：

1、用肝素化玻(bo)璃(li)毛細管（如環帽(mao)）從眶后神經叢抽取50µL血液，放入1.5 ml含有(you)200µLTris緩沖鹽(yan)水/肝素（20 U/ml）的試管中。

2、在1 mL Tyrode緩沖(chong)液中稀釋，用于流式細胞儀分析。

3、為了制備洗滌(di)過的(de)血液，將稀(xi)釋的(de)血液以900 x g離心5分鐘，去除上清液，并(bing)將沉淀重懸在1.25 mL Tyrode緩沖液(ye)中。

4、在(zai)實驗開(kai)始前(qian)直接加入1mM CaCl₂。

注：對于凝(ning)血酶(mei)誘導的血小板活(huo)化，必須去除血漿以(yi)防止抗凝(ning)血酶(mei)活(huo)性。

血小板(ban)制備：

1、制(zhi)備洗滌過的血小板是一種更耗時(shi)的方法，需要大量的血液，但產生的血小板制(zhi)劑(ji)可以使用數小時(shi)。

2、用1.5 cm玻(bo)璃毛細管從(cong)眶后叢收集0.5-1 mL血液，放入含(han)有200 µL TBS/肝素（20 U/ml）的1.5 mL管中。去(qu)除含有(you)一些紅(hong)細胞(bao)的上清。

3、以500 x g離(li)心樣品5分鐘，并將富含血小板的(de)血漿（PRP）轉(zhuan)移到新的試管中。

4、將(jiang)血小板懸(xuan)浮液以(yi)300 x g離心8分(fen)鐘，并將(jiang)不(bu)含任何(he)紅(hong)細(xi)胞的(de)PRP轉移到(dao)新的試管中。

5、加入(ru)0.5 µM前列環素（PGI2），以1300 x g離(li)心5分(fen)鐘。

6、將血小板顆粒重新懸浮在1 mL Tyrode緩沖液中，加入(ru)0.02 U/mL腺苷三磷(lin)酸雙磷(lin)酶和0.5 µM前列環素(su)，在(zai)37℃下孵育5分鐘，并在1300 x g下離心5分鐘。

7、重復步驟5，將血小板顆粒重(zhong)懸于0.5 ml Tyrode緩沖液(ye)中，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸雙磷酶，并在37℃下孵育30分鐘(zhong)。

血小板表面糖蛋白(bai)的(de)單(dan)色分析(xi)：

1、將5 µL特異(yi)性(xing)或陰(yin)性(xing)對照抗(kang)體和25 µL稀(xi)釋(shi)的(de)全(quan)血在分析管中混(hun)合，渦旋混(hun)勻1-2秒。

2、在室溫下孵育(yu)15分鐘(zhong)。

3、加(jia)入(ru)400 µL PBS停止反應，并在30分鐘內進行(xing)分析。

如所述，將樣(yang)品與FITC綴(zhui)合的(de)對照IgG（黑線(xian)）、GPVI抗體(ti)或GPV抗(kang)體孵育。血(xue)小板通過前向散射（FSC）/側(ce)散(san)射(she)（SSC）血小板通(tong)過前向（FSC）/側(ce)向（SSC）散射特征進行篩選。在單獨的直方圖中(zhong)顯示了被篩選（R1）的(de)血小(xiao)板的(de)熒光(guang)（FL1）強(qiang)度。RBC：紅細胞(bao)。

血小板活化的雙色分析：

1、將5 µL特異性(xing)或(huo)陰性(xing)對照抗體與5 µL泛血小板標記物一起加入測定(ding)管中。

2、此時(shi)，加入(ru)小體積（<5 µL）的(de)任(ren)何額外的試劑（如抑制劑）。

3、加入26 µL稀釋(shi)的(de)全血或經(jing)洗滌過的(de)血小板（100萬），渦旋混勻1-2秒。

在室溫下孵(fu)育15分(fen)鐘。加入(ru)400 µL PBS停止反應(ying)，并在30分鐘內(nei)進行分析。

小(xiao)鼠血小(xiao)板分別與(yu)PBS或0.1U/mL的凝血酶(mei)（thrombin）一起與FITC和(he)PE結合(he)的(de)mAbs一起孵育(yu)。通過GPIX或(huo)GPIIbIIIa（FL1; gate 1）的表(biao)達對血小板進行了(le)篩選。

二、免疫(yi)組織化(hua)學（用丙酮固定冷凍切片）

請注(zhu)意：不建議在（對(dui)）甲醛(quan)固定(ding)的(de)樣本上進行免疫組織化學染(ran)色，因為(wei)大(da)多數(shu)大(da)鼠抗體(ti)在這些條(tiao)件下對小鼠組織(zhi)的(de)效(xiao)果很(hen)差(cha)。

1、將冷凍組織的(de)切片放在玻(bo)片上，并(bing)在4°C下(xia)的冰冷100%丙酮(tong)中固(gu)定20分(fen)鐘。在室溫(wen)下干燥一整夜。

2、為了減少(shao)試劑的(de)用量，在玻(bo)片上的(de)組(zu)織(zhi)切片周圍可以(yi)用防水筆畫一個疏水圈(quan)。在所有(you)后續(xu)的(de)步驟(zou)中，這個圈(quan)起(qi)來(lai)的(de)區域(yu)都不應該干燥。因此，建議在潮濕的(de)盒子中進行孵(fu)育(yu)步驟(zou)。

3、在PBS中孵育玻片(pian)20分(fen)鐘。

4、使用過(guo)氧化物(wu)酶(mei)結(jie)合(he)的(de)二抗時，將玻(bo)片在(zai)室溫下與0.03%的H₂O₂孵育10分鐘(zhong)以抑制內源過(guo)氧(yang)化物(wu)酶活性。在PBS中(zhong)三次洗滌玻(bo)片(pian)，每(mei)次5分鐘。

5、用PBS稀釋（比例1:10或1:100）的封(feng)閉液(ye)（二抗(kang)體宿(su)主物種的血(xue)清），室(shi)溫(wen)下孵(fu)育玻片1小時。

6、一抗（2-10 µg/ml）室溫孵育(yu)2小時。

7、吸取多余液體，然(ran)后在(zai)PBS中洗滌三次，每次5分(fen)鐘。

8、用熒光素或過氧化物酶結(jie)合的(de)二抗(kang)（例如：親和(he)純化的(de)驢抗(kang)大鼠IgG-FITC或HRP）覆蓋玻片，按照(zhao)說明書在封閉液中稀釋(shi)，室溫(wen)下(xia)孵育1小時(shi)。

9、吸(xi)取多余液(ye)體(ti)，PBS洗(xi)滌三次，每次(ci)5分鐘。

10、熒光染(ran)色(se)的樣本可以直接通過熒光顯(xian)微鏡分析。

11、為了可(ke)視化過氧(yang)化物酶標記的組織，用新鮮制備(bei)的3-氨基(ji)-9-乙基咔唑(zuo)（AEC）底物覆蓋玻片，并(bing)在顯微鏡下可見紅色染色，時間可在5至30分鐘(zhong)之間變化(hua)。在橙色(se)背景染色(se)出現之前，用去離子水沖洗停止反應。用伊紅染(ran)色30-240秒，然后在溫水中(zhong)沖洗玻(bo)片20分鐘(zhong)。使用水溶性封裝溶液(ye)固定切片。

三、免疫沉(chen)淀

緩(huan)沖(chong)液和試劑準備(bei)：

PBS/EDTA：137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、8.0mM Na₂HPO₄ x 2H₂O，pH 7.3；5 mM EDTA。

IP緩沖液(ye)：40 mM Tris/HCl、0.3 M NaCl、1 mM EDTA、2 mM PMSF、10µg/mL Leupeptin蛋白酶抑(yi)制劑、10µg/mL Aprotinin抑肽酶、1µg/mL Pepstatin胃蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑。

Igepal非離子(zi)表面活性劑：10%的H₂O溶液(ye)。

2x SDS樣品緩沖液：10%β-巰(qiu)基乙醇（用(yong)于還原緩(huan)沖液(ye)）、10%Tris緩沖液（1.25 M）、20%甘油(you)、4%SDS、0.02%溴酚藍(lan)。

1、將小(xiao)鼠血小(xiao)板(ban)或細胞在1 mL PBS/EDTA（5分鐘(zhong)，1300 x g）中洗滌3次，并使用IP緩(huan)沖液重懸(xuan)。

2、加入1%Igepal 在(zai)室溫下溶解血(xue)小板(ban)（15–20分鐘）。

3、10000 x g下離(li)心5分(fen)鐘(zhong)去除(chu)細胞碎片，并將(jiang)上清(qing)液轉移(yi)到新(xin)的試管中。

4、加(jia)入20µL洗滌過的(de)protein G agarose（PGA）。在4°C下(xia)混(hun)勻孵育至(zhi)少3小時。

5、3000 x g離心樣(yang)品5分鐘。將上清液轉(zhuan)移(yi)到新的試管中(zhong)，以說明(ming)書中給定的濃(nong)度（通常在(zai)2-5µg/mL之間）加(jia)入抗體(ti)，30分鐘(zhong)后加入(ru)25µL洗滌過的(de)PGA。在4°C下混勻(yun)孵育至少2小時，最(zui)好過(guo)夜。

6、將樣品在3000 x g下離心(xin)1分鐘，向PGA中加入1 mL含有1%Igepal的1 x IP緩沖液(ye)。在3000 x g下離心1分鐘。

7、用IP緩沖液中洗(xi)滌(di)PGA兩次（3000 x g離心1分鐘(zhong)）。

8、加入25µL 1x SDS樣(yang)品緩沖液（還原(yuan)或(huo)非(fei)還原(yuan)），將(jiang)PGA重懸，煮沸5分鐘。9、然后(hou)將樣品冷凍(dong)（-20°C）以備日后使(shi)用，或(huo)者(zhe)進行SDS-PAGE和免(mian)疫印跡分析。

四、免疫印跡分析（Western Blot Analysis）

緩沖液(ye)和試劑準(zhun)備：

裂解緩(huan)沖液(ye)：40mM Tris/HCl、0.3M NaCl、1mM EDTA、0.05%NaN₃、1%Igepal。

PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH₂PO₄、8.0 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O，pH 7.3。

5%脫(tuo)脂(zhi)牛奶-PBS：含(han)5%脫脂奶(nai)粉的PBS。

PBS/T：PBS含0.1%吐(tu)溫20。

1%脫脂牛奶-PBS/T：含1%脫(tuo)脂牛奶(nai)的PBS/T。

所有步驟都可在室溫下(xia)進(jin)行(xing)：

1、在裂解緩(huan)沖液(ye)中制備小(xiao)鼠血小(xiao)板或細胞的(de)裂解物，并(bing)與（2x）SDS樣品緩(huan)沖液在95°C下孵育5分鐘。

2、根據說明書，在(zai)還(huan)原或非(fei)還(huan)原條(tiao)件下，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質，并將蛋白質轉移到(dao)PVDF膜上。

3、用5%脫脂牛奶(nai)封閉膜1小時。

4、加入PBS/T-1%牛奶稀釋的一抗（2-5µg/mL），孵(fu)育1小時。

5、用PBS/T沖洗(xi)膜兩次，30分鐘。洗(xi)滌程序可以(yi)減少(shao)到三次，每次10分(fen)鐘(zhong)。

6、加入(ru)PBS/T-1%牛奶(nai)稀釋的二抗（HRP偶聯的抗(kang)大鼠Ig），孵育45-60分鐘。

7、用PBS/T沖洗膜兩(liang)次，30分鐘。

8、使用(yong)ECL（化(hua)學發光）顯色。

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